ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用方面可用于疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。按照待测物性质的不同，ELISA反应可以分为抗原检测反应及抗体检测反应。
在医学领域上，能够进行检测的抗原包括：内分泌方面的雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等，血液学方面的凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等，肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌坯抗原（CEA），此外还有霍乱弧菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和破伤风梭菌毒素；脑膜炎球菌及淋球菌抗原；检测免疫抑制病人中常见的白色念殊菌抗原，检测病人或病兽的粪便中的轮状病毒；检测甲肝病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨细胞病毒等。
而用ELISA检测抗体，已获得对多种传染病和寄生虫病的血清学诊断，亦开始广泛用于现场流行病学调查。在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断，这对人医和兽医都很重要。在病原微生物方面已用于检测链球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、假丝酵母菌等的抗体，还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体作诊断，也可用于对立克次氏体的种属鉴别，还有用于检测鹦鹉热衣原体抗体的报导。ELISA也可应用于以下病毒抗体检测：流感病毒、腮腺炎病毒、麻诊、风疹、轮状病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、肠道病毒、脑炎病毒、黄热病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等，其敏感性都超过目前常用的检测方法。此外，还可用于鉴定病毒型别，例如疱疹病毒。在免疫性疾病方面有试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测各种过敏原的抗体DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等。在卫生学方面，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。
ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：
1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
2、研究抗酶抗体的合成。
3、显现微量的免疫沉淀反应。
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
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